Sette nuovi metaboliti di Drostanolone eptanoato usando Beauveria Bassiana e Macrofomina

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Sette nuovi metaboliti di drostanolone eptanoato usando Beauveria Bassiana e colture di sospensione cellulare di Macrofomina Phaseolina †

Zahid Hussain A, Atia-Tul-Wahab * B, Nusrat Hussain AC, Shabbir Hussain AD, Atta-Ur-Rahman A e M. Iqbal choudhary * abe
a h. E. J. Research Institute of Chemistry, International Center for Chemical and Biological Sciences, University of Karachi, Karachi-75270, Pakistan. E-mail: Iqbal.choudhary@iccs.edu; Fax: +922134824924-5; Tel: +922134824924-5
B DR. Panjwani Center for Molecular Medicine and Drug Research, International Center for Chemical and Biological Sciences, University of Karachi, Karachi-75270, Pakistan
C Dipartimento di Chimica, Università di Baltistan Skardu, 16100, Pakistan
D Dipartimento di Chimica, Karakoram International University, Gilgit-15100, Gilgit-Baltistan, Pakistan
E Dipartimento di Biochimica, Facoltà di Scienze, King Abdulaziz University, Jeddah-21412, Arabia Saudita

Ricevuto il 29 luglio 2019, accettato il 6 dicembre 2019

Pubblicato per la prima volta il 2 gennaio 2020

Astratto

Il presente studio riporta la biotrasformazione di uno steroide anabolico-androgenico (AAS) drostanolone eptanoato (1) utilizzando due colture microbiche, Beauveria Bassiana e Macrofomina Phaseolina . Fermentazione di 1 con b. Bassiana ha prodotto cinque nuovi prodotti trasformati 2–6, mentre con m. Phaseolina ha offerto due nuovi 7–8, e due noti 9–10 metaboliti. I principali siti di idrossilazione nello scheletro steroideo di 1 erano a C-5, C-7, C-11, C-14, C-15 e C-20, idrolisi della porzione estere a C-17 e riduzione del gruppo carbonile a C-3. Le strutture dei prodotti trasformati sono state determinate utilizzando la massa, la NMR e altre tecniche spettroscopiche.

introduzione

Gli steroidi costituiscono un’importante classe di composti biologicamente attivi a causa delle loro proprietà anaboliche, antinfiammatorie, antimicrobiche, anti-leishmanial e anticancro. Pertanto, ci sono stati sforzi sostenuti per la sintesi di nuovi e derivatizzazioni di farmaci steroidei esistenti con profili farmacodinamici desiderati. Attualmente è stato in gran parte impiegato un approccio bio-catalitico per le modificazioni strutturali degli steroidi, in particolare a causa della capacità dei microrganismi di catalizzare la funzionalizzazione in quasi tutti i siti dello scheletro steroideo inerte. 1–3 Inoltre, i microrganismi possono crescere e replicare rapidamente e produrre una varietà di enzimi in condizioni ambientali. Le biotrasformazioni sono state impiegate con successo in cui i metodi chimici sono risultati difficili e costosi. Inoltre, i prodotti ottenuti sono altamente regionali, enantio e stereo-selettivi e le procedure sono ecologiche ed economiche. 4,5

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Drostanolone eptanoato (1) (C27H44O3) è un steroide androgenico anabolico derivato dal diidrotestosterone (DHT) (AAS). Atleti e Body Builders lo usano per aumentare la forza dei muscoli e la massa corporea senza guadagnare grasso. 6 Tuttavia, a causa dei suoi effetti avversi sul fegato, sui lipidi sierici e sul sistema riproduttivo, l’uso del drostanolone eptanoato (1) e altri steroidi androgeni anabolici sono stati ora sospesi dal Comitato Olimpico Internazionale (CIO). 7 Al contrario, molti gruppi di ricerca hanno studiato il trattamento del carcinoma mammario dipendente dagli estrogeni utilizzando 1 Come inibitore dell’aromatasi. 8-11

Numerosi prodotti bio-trasformati di drostanolone dalle urine di conigli dosti al drostanolone sono stati riportati in letteratura, tra cui idrossilazioni a C-15, C-16 e C-17, riduzione a C-3 e ossidazione a C-17. 12 Allo stesso modo, sono anche riportati diversi metaboliti di drostanolone sull’incubazione con epatociti umani crioconservati. 13

In continuazione dei nostri studi di trasformazione strutturale sui farmaci steroidei, 14-20 biotrasformazione del drostanolone eptanoato (1) è stata effettuata. Basato su risultati di screening su piccola scala, composto 1 è stato sottoposto a biotrasformazione utilizzando due colture cellulari microbiche, Beauveria Bassiana e Macrofomina Phaseolina, per la prima volta, producendo sette nuovi e due composti noti. Lo scopo di questo studio era di sintetizzare analoghi strutturalmente diversi di drostanolone eptanoato (1) per il loro potenziale utilizzo nella ricerca biomedica, impiegando procedure di biotrasformazione lievi e a basso costo.

Sperimentale

Generale

Tutte le sostanze chimiche utilizzate per la trasformazione microbica sono state acquistate dal Sigma Aldrich (Germania) e Oxoid Limited (Regno Unito), mentre il drostanolone eptanoato (1) è stato acquistato dalla Shanghai BetterSyn Biotech Co., Ltd., Shanghai, Cina). Piastre di cromatografia a strato sottile pre-rivestito in silice (TLC) (E. Merck, Germania) e cromatografia su colonna in gel di silice (Germania) sono state usate per l’analisi e fraziona (purificazione iniziale), mentre la fase inversa preparativa HPLC-LC-908, dotata di colonne Jaigel-Ods-L-80 (Giappone), è stato utilizzato per la purificazione finale dei prodotti trasformati. Le tecniche FAB- e HRFAB-MS (Jeol HX110) (Giappone) ed ESI- e HRESI-MS (Bruker, Maxis II) (Germania) sono state usate per dedurre le formule molecolari di tutti i composti. Il 1 H- e il 13 Gli spettri C-NMR sono stati registrati sugli spettrometri di Bruker Avance (300–600 MHz) (Svizzera). I punti di fusione sono stati registrati usando Stuart SMP-10 Strumento (Svizzera). Il polarimetro Jasco P-200 è stato utilizzato per misurare le rotazioni ottiche, mentre i dati IR sono stati registrati utilizzando i dischi KBR in CHCL3 Sullo spettrometro Bruker Vector 22 ft-IR (Giappone). L’acido molibdofosforico (MPA) è stato usato come reagente di colorazione per rilevare i prodotti trasformati su TLCS.

Culture microbiche e preparazione dei media

Beauveria Bassiana (ATCC-7159) è stata acquistata dalla American Type Culture Collection, mentre la Macrofomina Phaseolina (KUCC-730) è stata ottenuta dalla Karachi University Culture Collection. Entrambe le colture sono state coltivate su inclinazioni di agar di destrosio di sabourauud e mantenute a 4 ° C.

I terreni di coltura per la crescita dei funghi sono stati preparati aggiungendo 50 g di glucosio, 25 g di peptone, 25 g di estratto di lievito, 25 g kh2Po4, 25 g di NaCl e glicerolo da 50 ml, in acqua distillata. La quantità e la ricetta per entrambe le culture erano le stesse.

Protocollo di fermentazione generale, estrazione e purificazione

I media per la crescita dei microrganismi sono stati preparati aggiungendo le quantità specifiche di ingredienti dei media in acqua distillata. I media sono stati quindi trasferiti a 100 ml di boccette Erlenmeyer, cotone collegati e autoclavetti a 121 ° C, seguita da inoculazione di spore di funghi da Micelia su SDA SLANTS in condizioni sterilizzate. Le boccette sono state posizionate su uno shaker rotante a 26 ° C per la massima crescita dei funghi. Dopo una crescita adeguata, substrato 1 è stato sciolto in acetone e ugualmente distribuito in ogni boccetta contenente i funghi, e di nuovo posizionato su uno shaker rotante a 26 ° C con 125 giri / min per il processo di fermentazione. Sono stati preparati un controllo positivo (solo substrato nei media) e un controllo negativo (coltura microbica nei media) per identificare rispettivamente la degradazione del substrato nei media e metaboliti fungini. La reazione di fermentazione è stata fermata aggiungendo diclorometano a ciascun pallone, seguita da filtrazione di biomassa fungina. Il filtrato è stato quindi estratto con diclorometano, essiccato aggiungendo solfato di sodio anidro, filtrato ed evaporato sotto vuoto alto per offrire un materiale grezzo solido. Questo materiale grezzo è stato quindi frazionato attraverso la cromatografia su colonna in gel di silice con esani a gradiente e eluizione acetone. Dopo l’analisi TLC, le frazioni di polarità simili sono state combinate insieme in dieci frazioni principali. Queste frazioni combinate sono state quindi sottoposte a riciclaggio preparativo RP-HPLC, usando un metanolo isocratico e sistemi di solvente d’acqua. Una portata costante di 4 ml min −1 è stato mantenuto durante l’analisi per isolare i metaboliti puri 2–10.

2α-metil-7α, 11α, 17β-trihidrossi-5α-Androstan-3-one (2). Solido bianco; punto di fusione: 230–233 ° C; [α] 25 D = −46.2 ° (c 0.017, MeOH); IR (CHCL3) λ max (centimetro −1 ): 3475, 3330, 3326 (3 × O – H), 1687 (C O); Tempo di ritenzione (min): 17 (MEOH: H2O; 75: 25); HRFAB-MS M / Z 337.2356 ([M + H] + ; calcd. 336.2301); FAB-MS M / Z 337 [M + H] + ; 1 H-NMR (CD3OD, 300 MHz): Tabella 1; 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz): Tabella 2.

Tabella 1 1 Assegnazioni di spostamento chimico H-NMR di composti 1–10 (Δ H, multiplicità [j = hz])

Posizioni 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2.08 dd (j = 12.6, 5.7); 1.05 m 2.44 dd (j = 13.8, 5.8); 1.98 m 2.10 m; 1.00 m 2.91 dd (j = 13.8, 6.0); 1.32 m 2.54 Br. t (j = 13.8); 1.88 dd (j = 13.8, 3.0) 2.44 Br. t (j = 13.8); 1.16 m 1.61 m; 1.04 m 1.35 m; 1.00 Br. t (j = 12.8) 2.08 dd (j = 13.2, 6.0); 1.04 m 1.34 m; 1.05 m
2 2.55 m 2.58 m 2.54 m 2.63 m 2.58 m 2.56 m 1.42 sovrapposizioni 1.41 m 2.55 m 1.51 m
3 – – – – – – 3.67 m 3.70 m – 3.69 m
4 2.42 Br. t (j = 13.8); 2.00 dd (j = 14.1, 3.3) 2.93 d (j = 6.0); 1.19 m 2.46 m; 2.08 m 2.44 Br. t (j = 14.1); 2.00 sovrapposizione 2.82 dd (j = 3.8, 4.8); 1.25 m 2.87 dd (j = 13.8, 5.7); 1.20 m 1.50 sovrapposizioni; 1.45 m 1.51 m; 1.39 m 2.87 Br. t (j = 13.5); 1.99 m 1.82 m; 1.54 m
5 1.54 m 1.60 m 1.57 m 1.57 m 1.49 m 1.55 m – 1.33 m 0.91 m 0.75 m
6 1.75 m; 1.31 sovrapposizioni 1.56 m; 1.42 m 1.63 m; 1.44 m 1.40 m; 1.37 m 1.57 sovrapposizioni; 1.43 m 1.37 m; 1.33 m 1.21 m; 1.18 m 1.41 m; 1.25 m 1.33 m; 1.30 m 1.61 m; 1.28 m
7 1.58 m; 1.32 sovrapposizioni 3.24 m 3.30 m 1.55 m; 1.26 m 3.77 m 2.06 m; 1.13 m 1.63 m; 1.53 m 1.53 m; 1.36 m 1.74 m; 0.88 m 1.21 m; 1.16 m
8 1.50 m 1.66 m 1.60 m 1.52 m 1.52 m 1.67 m 1.43 m 1.71 m 1.46 sovrapposizioni 1.42 m
9 0.77 m 0.88 Br. t (j = 10.2) 0.82 m 0.86 Br. t (j = 10.2) 1.42 m 0.86 Br. t (j = 10.2) 1.73 m 1.48 m 1.47 sovrapposizioni 1.66 m
10 – – – – – – – – – –
11 1.40 m; 1.33 sovrapposizioni 3.92 dt (j = 10.5, 5.1) 1.67 m; 1.66 m 3.93 dt (j = 10.8, 5.0) 3.88 dt (j = 10.8, 5.1) 3.87 m 1.51 sovrapposizioni; 1.41 sovrapposizioni 1.56 m; 1.32 m 1.56 m; 1.40 m 1.67 m; 0.89 m
12 1.18 dt (j = 12.9, 3.9); 1.71 m 2.08 dd (j = 12.0, 4.8); 1.10 m 1.82 m; 1.10 m 2.11 dd (j = 12.0, 4.8); 1.10 m 2.06 sovrapposizione; 1.07 Br. t (j = 11.7) 2.07 sovrapposizione; 1.16 m 1.57 m; 1.44 m 1.43 m; 1.25 m 1.85 m; 1.01 m 1.42 m; 1.00 m
13 – – – – – – – – – –
14 1.08 m 1.20 m 1.03 m 1.08 m 1.40 m 1.05 m 1.55 m – 0.91 m 0.95 m
15 2.12 m; 1.47 m 1.88 m; 1.67 m 4.06 dt (j = 9.0, 4.8) 1.73 m; 1.70 m 1.68 m; 1.26 m 3.90 m 1.37 m; 1.33 m 1.64 m; 1.51 m 3.90 m 1.57 m; 1.24 m
16 1.52 m; 1.47 m 1.95 m; 1.44 m 2.04 m; 1.93 m 2.02 sovrapposizione; 1.48 m 2.01 m; 1.56 sovrapposizioni 2.05 sovrapposizione; 1.84 m 1.98 m; 1.46 m 2.14 m; 1.52 m 1.53 m; 1.26 m 1.94 m; 1.46 m
17 4.58 t (j = 8.7) 3.55 t (j = 8.4) 3.74 t (j = 9.0) 3.59 t (j = 8.7) 3.60 t (j = 8.4) 3.78 t (j = 9.0) 3.61 t (j = 8.4) 4.20 t (j = 7.2) 3.55 t (j = 8.7) 3.54 t (j = 8.4)
18 0.83 s 0.77 s 0.78 s 0.76 s 0.75 s 0.76 s 0.72 s 0.81 s 0.74 s 0.71 s
19 1.12 s 1.24 s 1.14 s 1.22 s 1.20 s 1.23 s 0.94 s 0.83 s 1.11 s 0.82 s
20 0.96 d (j = 6.3) 0.94 d (j = 6.6) 0.97 d (j = 6.3) 3.75 dd (j = 10.8, 5.1); 3.47 dd (j = 11.1, 5.7) 0.93 d (j = 6.3) 0.93 d (j = 6.3) 0.91 d (j = 5.4) 0.91 d (j = 6.8) 0.94 d (j = 6.6) 0.91 d (j = 6.9)
21 – – – – –
22 2.29 t (j = 7.2) – – – –
23 1.59 m; 1.32 sovrapposizioni – – – –
24 1.38 sovrapposizioni; 1.33 sovrapposizioni – – – –
25 1.30 sovrapposizioni; 1.29 sovrapposizioni – – – –
26 1.34 sovrapposizioni; 1.30 sovrapposizioni – – – –
27 0.90 t (j = 6.9) – – – –

Tavolo 2 13 Assegnazioni di cambio chimico C-NMR di composti 1–10

Carboni 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 49.8 45.6 49.3 45.7 45.6 46.1 35.1 42.3 49.9 42.2
2 42.1 42.2 42.0 49.9 42.8 42.3 31.3 33.1 42.1 40.0
3 215.4 215.5 215.0 214.3 215.5 215.9 71.3 71.4 215.6 71.4
4 45.5 51.2 45.0 46.3 51.4 51.7 38.0 37.8 45.6 38.1
5 36.3 47.4 46.6 50.2 42.8 50.5 77.0 48.8 55.2 56.1
6 32.4 40.2 37.8 30.3 38.0 30.4 29.3 29.2 29.8 21.5
7 26.2 75.0 74.8 24.2 67.4 33.0 27.5 27.0 32.5 29.4
8 49.4 43.3 44.8 36.1 40.2 35.9 33.2 40.2 36.6 36.6
9 55.2 59.1 58.5 60.9 52.9 61.0 49.6 39.7 49.6 33.1
10 37.3 38.8 45.8 39.0 44.1 39.3 42.4 37.6 37.7 37.4
11 29.8 69.6 22.1 69.5 69.7 69.2 24.1 20.6 22.2 32.9
12 38.2 49.4 38.2 49.0 48.5 49.6 33.4 30.0 38.0 37.8
13 43.9 44.9 58.4 44.4 49.6 45.6 44.1 49.0 44.1 44.1
14 51.9 51.1 52.1 51.3 45.9 58.5 44.8 84.8 52.2 52.4
15 28.5 27.2 73.1 32.4 23.4 72.5 26.2 32.7 72.5 24.3
16 23.5 31.1 40.5 30.7 30.6 43.0 30.6 30.1 24.3 30.6
17 84.0 81.8 79.5 81.9 82.0 79.2 82.3 79.6 79.2 82.5
18 12.6 12.6 13.3 12.5 12.3 13.9 10.8 15.7 11.6 11.7
19 14.2 12.9 12.7 12.9 11.9 13.0 14.7 12.3 12.6 12.6
20 14.9 15.0 14.9 62.5 15.0 15.0 19.2 19.0 15.0 19.0
21 175.5 – – – – – – – – –
22 35.3 – – – – – – – – –
23 26.2 – – – – – – – – –
24 29.8 – – – – – – – – –
25 32.6 – – – – – – – – –
26 23.5 – – – – – – – – –
27 14.3 – – – – – – – – –

2α-metil-7α, 15α, 17β-trihidrossi-5α-Androstan-3-one (3). Solido incolore; punto di fusione: 236–238 ° C; [α] 25 D = +25 ° (c 0.028, MeOH); IR (CHCL3) λ max (centimetro −1 ): 3733, 3375, 3278 (3 × O – H), 1687 (C O); Tempo di ritenzione (min): 19 (MEOH: H2O; 75: 25); HRFAB-MS M / Z 337.2372 ([M + H] + ; calcd. 336.2301); FAB-MS M / Z 337 [M + H] + ; 1 H-NMR (CD3OD, 300 MHz): Tabella 1; 13 C-NMR (CD3OD, 150 MHz): Tabella 2.

2α-idrossimetil-11α, 17β-diidrossi-5α-Androstan-3-one (4). Solido bianco; punto di fusione: 145–147 ° C; [α] 25 D = +43.8 ° (c 0.021, MeOH); IR (CHCL3) λ max (centimetro −1 ): 3737, 3410, 3369 (3 × O – H), 1703 (C O); Tempo di ritenzione (min): 18 (MEOH: H2O; 70: 30); HRFAB-MS M / Z 337.2366 ([M + H] + ; calcd. 336.2301); FAB-MS M / Z 337 [M + H] + ; 1 H-NMR (CD3OD, 300 MHz): Tabella 1; 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz): Tabella 2.

2α-metil-7β, 11α, 17β-trihidrossi-5α-Androstan-3-one (5). Solido incolore; punto di fusione: 202–205 ° C; [α] 25 D = +78.7 ° (c 0.024, MeOH); IR (CHCL3) λ max (centimetro −1 ): 3743, 3429, 3375 (3 × O – H), 1699 (C O); Tempo di ritenzione (min): 26 (MEOH: H2O; 70: 30); HRFAB-MS M / Z 337.2365 ([M + H] + ; calcd. 336.2301); FAB-MS M / Z 337 [M + H] + ; 1 H-NMR (CD3OD, 300 MHz): Tabella 1; 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz): Tabella 2.

2α-metil-11β, 15α, 17β-trihidrossi-5α-Androstan-3-one (6). Solido incolore; punto di fusione: 244–246 ° C; [α] 25 D = +27.4 ° (c 0.028, MeOH); IR (CHCL3) λ max (centimetro −1 ): 3733, 3421, 3305 (3 × O – H), 1689 (C O); Tempo di ritenzione (min): 24 (MEOH: H2O; 70: 30); HRFAB-MS M / Z 337.2372 ([M + H] + ; calcd. 336.2301); FAB-MS M / Z 337 [M + H] + ; 1 H-NMR (CD3OD, 300 MHz): Tabella 1; 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz): Tabella 2.

2α-metil-3β, 14α, 17β-trihidrossi-5α-Androstane (8). Solido bianco; punto di fusione: 272–275 ° C; [α] 25 D = +21.8 ° (c 0.02, Meoh); IR (CHCL3) λ max (centimetro −1 ): 3377 (O – H); Tempo di ritenzione (min): 27 (MEOH: H2O; 75: 25); HRESI-MS M / Z 323.2586 ([M + H] + ; calcd. 322.2508); ESI-MS M / Z 323.3 [M + H] + ; 1 H-NMR (CD3OD, 400 MHz): Tabella 1; 13 C-NMR (CD3OD, 100 MHz): Tabella 2.

Risultati e discussione

Biotrasformazione del drostanolone eptanoato (1) con colture di sospensione cellulare di B. Bassiana e M. Phaseolina ha prodotto nove prodotti trasformati 2–10. B. Bassiana ha prodotto cinque nuovi metaboliti 2–6 (Schema 1), mentre m. Phaseolina ha offerto due nuovi 7 e 8, e due noti 9 e 10 Metaboliti (Schema 2). Le strutture di nuovi composti sono state dedotte utilizzando diverse tecniche spettroscopiche e confrontando i loro dati spettrali con il substrato 1. Le strutture dei metaboliti noti sono state determinate anche confrontando i dati spettroscopici con i dati riportati.

Schema 1 Biotrasformazione del drostanolone eptanoato (1) con b. Bassiana .
Schema 2 Biotrasformazione del drostanolone eptanoato (1) con m. Phaseolina .

Metabolita 2 è stato purificato come solido otticamente attivo e incolore attraverso il riciclaggio RP-HPLC. HRFAB-MS ha mostrato il [M + H] + a m / z 337.2356 (calcd. 336.2301, c20H32O4), 24 AMU minore del substrato 1. Questo ha suggerito idrolisi del gruppo estere e aggiunta di due atomi di ossigeno. Bande di assorbimento a ν max (centimetro −1 ) 3475, 3330, 3326 e 1687 furono osservati negli spettri IR per tre OH e un gruppo carbonilico. Nel 1 Spettro H-NMR, tre segnali di methine in discesa a Δ 3.92 (dt, j 11a, 9a/12a = 10.5 Hz, J 11a, 12e = 5.1 Hz), 3.55 (t, j 17α, 16α/β = 8.4 Hz) e 3.Sono comparsi 24 (m), indicando la presenza di gruppi idrossilici. Allo stesso modo, sono stati osservati segnali di downfield per i carboni di ossymetine nel 13 Spettro C-NMR a Δ 81.8, 75.0 e 69.6. Nello spettro HMBC del composto 2 (Fig. 1), H-12 ha mostrato le interazioni HMBC con C-9, C-11, C-14, C-17 e C-18, supportando le posizioni di entrambi i gruppi OH a C-11 e C-17. Allo stesso modo, H-9 ha mostrato picchi incrociati con C-7, C-8, C-10, C-11 e C-14, hanno suggerito gruppi OH su C-7 e C-11. La configurazione di H-7, H-11 e H-17 sono state dedotte come β, β e α (Fig. 2), in base alle correlazioni di NOESY di H-7 con H-8 orientato a β e H-11 con H orientato a β3-19 e h3-18 (Fig. 2). Pertanto, la struttura del nuovo metabolita è stata determinata come 2α-metil-7α, 11α, 17β-triidrossi-5α-Androstan-3-one (2).

Fig. 1 Chiave interazioni HMBC dei metaboliti 2–8.
Fig. 2 Chiave Cozy e Noesy Interactions nei metaboliti 2–8.

Composto 3 è stato ottenuto come solido otticamente attivo e incolore usando il riciclaggio di RP-HPLC. HRFAB-MS ha mostrato il [M + H] + a m / z 337.2372 (calcd. 336.2301, c20H32O4), suggerendo idrolisi del gruppo estere e aggiunta di due atomi di ossigeno. Questo era 24 AMU minore del substrato 1. IR ha mostrato bande di assorbimento a ν max (centimetro −1 ) 3733, 3375, 3278 e 1687 per tre OH, e un gruppo carbonilico. Il 1 H- e il 13 Spettri C-NMR di composti 2, e 3 sono stati trovati distintamente simili. Nel 1 Spettro H-NMR, tre segnali di methine in discesa a Δ 4.06 (dt, j 15β, 16α/β = 9.0 Hz, J 15β, 14α = 4.8 Hz), 3.74 (t, j 17α, 16α/β = 9.0 Hz) e 3.30 (m) sono stati assegnati al geminale dei protoni ai gruppi OH. Coerente con queste osservazioni, il 13 Lo spettro C-NMR ha mostrato risonanze dei carboni di methine a Δ 79.5, 74.8 e 73.1. Tuttavia, gli spettri HMBC, Cozy e Noesy di entrambi i composti sono stati trovati diversi. Composto 3 interazioni HMBC visualizzate (Fig. 1) di H-9 con C-5, C-7, C-10 e C-19, suggerendo uno dei gruppi OH su C-7. Allo stesso modo, gli altri due gruppi OH sono stati collocati a C-15 e C-17, in base alle correlazioni HMBC di H-16 con C-13, C-15 e C-17. La configurazione di H-7, H-15 e H-17 è stata dedotta come β, β e, in base alle correlazioni di NOESY di H-7 con H-8 orientato a β, H-15 con H assialmente3-18 e H-17 con H-14 orientato a α (Fig. 2). Pertanto, la struttura del nuovo composto è stata dedotta come 2α-metil-7α, 15α, 17β-trihidrossi-5α-Androstan-3-one (3).

Metabolita 4 è stato ottenuto come solido bianco usando il riciclaggio di RP-HPLC. L’Hrfab-MS di 4 ha mostrato il [M + H] + a m / z 337.2366 (calcd. 336.2301, c20H32O4) suggerendo l’aggiunta di due atomi di ossigeno, insieme alla perdita idrolitica della porzione estere. Lo spettro IR ha rivelato la presenza di tre OH (3737, 3410 e 3369 cm −1 ) e un carbonile (1703 cm −1 ) gruppi. Segnale per i protoni metilici C-20 in 1 Lo spettro H-NMR è stato anche trovato mancante. Un ulteriore segnale di downfield a Δ 62.5 per C-20 in 13 Lo spettro C-NMR ha anche indicato l’ossidazione del gruppo metilico come CH2-OH. Nuovi segnali di Downfield per H-11 a Δ 3.93 (DT, J 11a, 9a/12a = 10.8 Hz, J 11a, 12a = 5.0 Hz), H-17 a Δ 3.59 (t, j 17α, 16α/β = 8.7 Hz) e H2-20 a Δ 3.75 (DD, J 20a, 20b = 10.8 Hz, J 20a, 2β = 5.1 Hz) e Δ 3.47 (DD, J 20b, 20a = 11.1 Hz, J 20b, 2β = 5.7 Hz) erano apparsi in 1 Spettro H-NMR. Ciò è stato ulteriormente stabilito attraverso le correlazioni HMBC (Fig. 1). Le correlazioni HMBC tra H-1 e C-2, C-3, C-5, C-10 e C-20 e da H-12 a C-9, C-11, C-13, C-14 e C-17 sono stati osservati. Queste correlazioni hanno supportato i gruppi OH a C-11, C-17 e C-20. Nello spettro accogliente (Fig. 2), l’omonucleare 1 H- 1 Sono stati osservati accoppiamenti H tra H-11 e H-9 e H-12, mentre H-2 ha mostrato i picchi incrociati accoglienti con H-1 e H2-20. La costante di accoppiamento di H-11 (dt, j 11a, 9a/12a = 10.8 Hz, J 11a, 12a = 5.0 Hz) e le sue correlazioni Noesy con H3-18 (Δ 0.76 s), implicava che il gruppo OH a C-11 era equatoriale (α) (Fig. 2). Allo stesso modo, H-17 ha mostrato picchi croce di Noesy con H-14, indicando un β-orientato del gruppo OH a C-17. Questo nuovo metabolita è stato quindi identificato come 2α-idrossimetil-11α, 17β-diidrossi-5α-Androstan-3-one (4).

Composto 5 è stato isolato come solido incolore attraverso il riciclaggio di RP-HPLC con un tempo di ritenzione di 26 minuti. Ha mostrato il [M + H] + a m / z 337.2365 (calcd. 336.2301, c20H32O4) in HRFAB-MS. Lo spettro IR ha mostrato bande di assorbimento a υ max (centimetro −1 ) 3743, 3429, 3375 e 1699, rispettivamente per OHS e un carbonile. Il 1 Mano 13 Spettri c-nmr del composto 5, sono stati trovati distintamente simili ai composti 2, e 3. Sono stati osservati tre nuovi segnali di downfield per protoni di ossymetine a Δ 3.88 (DT, J 11a, 9a/12a = 10.8 Hz, J 11a, 12e = 5.1 Hz), 3.77 (m) e 3.60 (t, j 17α, 16α/β = 8.4 Hz) nel 1 Spettro H-NMR. Allo stesso modo, 13 Spettro C-NMR di 5 ha mostrato segnali in discesa per i carboni di ossymetine a Δ 69.7, 67.4 e 82.0. Le posizioni dei gruppi OH a C-11 e C-17 sono state dedotte attraverso le correlazioni HMBC (Fig. 1) di H-12 (Δ 2.06, sovrapposizione; Δ 1.07 Br. t; J 12a, 12e/11a = 11.7 Hz) con C-9 (Δ 52.9), C-11 (Δ 69.7), C-13 (Δ 49.6), C-14 (Δ 45.9) e C-17 (Δ 82.0) ha indicato i gruppi OH a C-11 e C-17. Allo stesso modo, il gruppo OH a C-5 è stato determinato attraverso le correlazioni HMBC di H-5 (Δ 1.52, m) con C-4 (Δ 51.4), C-7 (Δ 67.4) e C-10 (Δ 44.1) (Fig. 1). Un gruppo OH a C-11 è stato dedotto come α sulla base delle interazioni NOESY (Fig. 2) di H-11 (Δ 3.88 dt, J 11a, 9a/12a = 10.8 Hz, J 11a, 12e = 5.1 Hz) con h assialmente h3-18 (Δ 0.75 s) e h3-19 (Δ 1.20 s). Allo stesso modo, le orienze β dei gruppi OH a C-7 e C-17 nel composto 5 sono stati dedotti attraverso le correlazioni di NOESY chiave dell’H-5 orientato assialmente con H-7 e H-14 orientato assialmente con H-17 (Δ 3.60 t, j 17α, 16α/β = 8.4 Hz), rispettivamente. La struttura di un nuovo metabolita è stata quindi dedotta come 2α-metil-7β, 11α, 17β-trihidrossi-5α-Androstan-3-one (5).

Metaboliti 6 è stato ottenuto come solido incolore usando RP-HPLC con un tempo di ritenzione di 24 minuti. La formula molecolare del composto 6 era coerente con C20H32O4, dedotto da HRFAB-MS a M / Z 337.2365 (calcd. 336.2301; [M + H] + ). Bande di assorbimento nello spettro IR a υ max (centimetro −1 ) 3733, 3421, 3305 e 1689 erano dovuti alla presenza di tre OHS e a un carbonile, rispettivamente. Il 1 Mano 13 Spettri C-NMR di composti 5, e 6 sono stati trovati distintamente simili ai composti 2, e 3. Il 1 Lo spettro H-NMR ha mostrato tre nuovi segnali di downfield per protoni methine a Δ 3.78 (t, j 17α, 16α/β = 9.0 Hz), 3.87 (m) e 3.90 (m). Segnali per i carboni metitine des -scield a Δ 69.2, 72.5 e 79.2 sono apparsi nel 13 Spettro C-NMR di 6. Ciò ha suggerito la presenza di tre gruppi OH. I gruppi OH a C-11, C-17 sono stati dedotti attraverso le correlazioni HMBC (Fig. 1) di H-12 (Δ 2.07 sovrapposizione; Δ 1.16 m) con C-9 (Δ 61.0), C-11 (Δ 69.2), C-13 (Δ 45.6), C-14 (Δ 58.5) e C-17 (Δ 79.2), mentre il gruppo OH a C-15 è stato determinato attraverso le correlazioni HMBC di H-16 con C-13, C-14, C-15 e C-17. Nello spettro Noesy (Fig. 2) del composto 6, Sono stati osservati picchi incrociati tra H-14 orientati assialmente e H-17 che suggeriscono l’orientamento β del gruppo OH a C-17. Allo stesso modo, la β-stereochimica dei gruppi OH a C-11 e il C-15 sono stati dedotti anche dalle correlazioni NOESY di H-11 con H-9 orientate assialmente e H-15 con H-8 orientati assialmente e H3-18. La struttura di un nuovo metabolita è stata quindi dedotta come 2α-metil-11β, 15α, 17β-trihidrossi-5α-Androstan-3-One (6).

Composto 7 è stato purificato come un solido bianco attraverso il riciclaggio di RP-HPLC con un tempo di ritenzione di 21 minuti. L’Hresi-MS del metabolita 7 ha mostrato il [M + NH4” + a m / z 340.2851 (calcd. 322.2508, c20H32O3). Ciò ha suggerito diidrossilazione, insieme all’idrolisi del gruppo estere a catena laterale. Lo spettro IR ha mostrato ampie assorbanze a isce max 3373 cm −1 Per i gruppi OH. Assenza del ponte segnali methine in 1 H- e il 13 Spettri c-nmr di 7 suggerito l’idrossilazione al carbonio terziario. Un gruppo OH a C-5 è stato dedotto attraverso le correlazioni HMBC di H-3, H3-19, h2-6 e H-9 con C-5 (fig. 1). La stereochimica del gruppo OH a C-3 è stata assegnata come β, basata su correlazioni NOESY di H-3 orientata assialmente con H equatorialmente3-20 (Fig. 2). Un gruppo OH a C-5 (Δ 77.0) è stato collocato come α, in base al confronto dei cambiamenti chimici riportati per 5α-OH negli steroidi. 15,20 Pertanto la struttura di un nuovo metabolita è stata identificata come 2α-metil-3β, 5α, 17β-triidrossi-Androstane (7).

Metabolita 8 è stato ottenuto come solido bianco usando RP-HPLC con un tempo di ritenzione di 27 minuti. Gli hresi-MS di 8 ha mostrato il [M + H] + a m / z a 323.2586 (calcd. 322.2508), indicando l’idrolisi del gruppo estere a catena laterale, insieme alla diidrossilazione. Ampie bande di assorbimento a υ max 3377 cm −1 Nello spettro IR era dovuto ai gruppi OH. Il 1 Mano 13 Spettri C-NMR del metabolita 7 erano apparentemente identici a 8. Assenza del ponte segnali methine in 1 Mano 13 Spettri c-nmr di 8 suggerito l’idrossilazione al carbonio terziario. Un gruppo OH al C-14 è stato dedotto attraverso le correlazioni HMBC di H-17, H-8, H2-15, h2-16 e h3-18 con C-14 (Fig. 1). La stereochimica relativa a C-3 nel composto 8 è stato dedotto dalle interazioni NOESY tra H-3 orientato assialmente e H equatorialmente orientato a H3-20 (Fig. 2). Allo stesso modo, il gruppo OH a C-14 è stato dedotto come α sulla base dello spostamento chimico riportato per 14α-OH in un composto steroideo simile. 18 Quindi la struttura di un nuovo composto è stata dedotta come 2α-metil-3β, 14α, 17β-triidrossi-5α-Androstane (8).

Metaboliti 9, e 10 sono stati ottenuti come solidi bianchi mediante cromatografia a colonna ripetuta. Hresi-MS di composto 9 ha mostrato il [M + H] + a m / z 305.2480 (calcd. 304.2402; C20H30O2) 47 AMU in meno del substrato 1, suggerendo idrolisi del gruppo estere a catena laterale. Mentre l’Hresi-MS del metabolita 10 a m / z 324.2902 (calcd. 306.2599; [M + NH4” + ) suggeriva una composizione molecolare di C20H34O2. Ciò indicava la riduzione del gruppo carbonilico chetonico, insieme all’idrolisi della catena laterale del substrato 1. Metaboliti 9, e 10 sono stati precedentemente segnalati da Templeton e Kim dalle urine di Drostanolone Dosed Conigli. 12 I dati spettroscopici dei metaboliti 9, e 10 era coerente con i dati della letteratura. Le loro strutture sono state identificate come 2α-metil-17β-idrossi-5α-Androstan-3-one (9) e 2α-metil-3β, 17β-diidrossi-5α-Androstane (10).

Conclusione

La biotecnologia microbica ha ampie applicazioni nella sintesi di librerie di analoghi strutturalmente diversi di prodotti naturali bioattivi e farmaci. Il presente studio ha offerto sette nuovi e due metaboliti noti di drostanolone eptanoato (1) utilizzando due colture microbiche, Beauveria Bassiana e Macrofomina Phaseolina . Incubazione di 1 con b. Bassiana ha portato alla sintesi di cinque nuovi metaboliti 2–6, mentre m. Phaseolina ha offerto due nuovi 7, e 8, e due prodotti trasformati noti 9, e 10. Idrossilazione, riduzione e idrolisi erano le reazioni principali durante la trasformazione strutturale di 1. I prodotti trasformati saranno valutati per potenziali attività biologiche in futuro. Inoltre, metaboliti 2–10 sarà anche studiato a livello enzimatico per comprendere il meccanismo coinvolto durante la biocatalisi.

Conflitto di interessi

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del Pakistan della Commissione per l’istruzione superiore attraverso un progetto del National Research Program for Universities (NRPU) (# 7993) intitolato “Sintesi di nuovi analoghi di agenti antinfiammatori tramite metodi biotecnologici microbici”.

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